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    產(chǎn)品展示Products
    PKC活性檢測實驗
    PKC活性檢測實驗
    更新時間:2025-02-05
    訪問量: 3587
    廠商性質(zhì): 生產(chǎn)廠家

    提供商:上海研謹(jǐn)生物/杭州研謹(jǐn)生物
    服務(wù)名稱:PKC活性檢測實驗
    規(guī)格: 實驗服務(wù)
    價格:200元
    收費標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:
    歡迎咨詢詳談,我們會根據(jù)您的方案及需求制定詳細的服務(wù)協(xié)議。
    更多實驗技術(shù)服務(wù)請瀏覽網(wǎng)站其他內(nèi)容,或來電詳詢!

    PKC活性檢測實驗產(chǎn)品概述:

    PKC活性檢測實驗試劑: 瓊脂糖(Promega公司,V3125) ;其他常備試劑購自sigma公司; PKC活性檢測試劑盒(Promega公司,V5330)

    實驗儀器:電泳儀(北京六一廠,112-0640) ;水平電泳槽(北京六一廠,122-3146) ;電熱恒溫培養(yǎng)箱(碧云天生物,EBI025) ;電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠,HH-8)

    基本原理:分離PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白),利用試劑盒組分將2種蛋白分離并加以區(qū)分,利用電泳瓊脂糖凝膠技術(shù)顯示2種不同的蛋白,利用分析軟件將顯示的不同蛋白定量并加以比較,以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值顯示PKC活性(PKC活化度)。


    PKC活性檢測實驗操作步驟:

    1.用預(yù)冷的勻漿器把細胞勻漿。

    2.在4°C,用14,000 xg離心裂解液5分鐘,保存上清。

    3.用PKC抽提液預(yù)平衡1ml的DEAE纖維素柱,再把第2步中得到的上清過柱。用5m的PKC抽提液洗柱子,然后用5ml含有200mM NaCI的PKC抽提液洗脫含有PKC的組分。

    4.用PKC稀釋液(PKC dilution buffer)將少量蛋白激酶C (Promtein Kinase C)稀釋到2 .5ug/ml.隨試劑盒所附的產(chǎn)品信息中標(biāo)有這個酶的初始濃度。

    5.用探頭超聲波破碎儀超聲處理PKC Activator Solution 20-30秒,或直到溶液變溫暖。

    6.對每一個樣品,按照下面所列順序在0.5ml小離心管中混合PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,超聲過的PKC Activator 5X Solution,和水。在樣品加入之前,小離心管--直要放在冰上。陰性對照將用于對反應(yīng)進行定量時確定其摩爾吸收值(說明書第IV部分) 。


    標(biāo)準(zhǔn)PKC檢測

    PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer           5ul

    PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul)            5ul

    PKC Activator 5X Solution,超聲處理的      5ul

    短肽保護液(非必須)                    1ul

    樣品                                 9ul

    去離子水使終體積為                   25ul


    PKC陽性對照檢測

    PepTag⑧PKC Reaction 5X Buffer          5ul

    PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)           5ul

    PKC Activator 5XSolution,超聲處理的      5ul

    短肽保護液(非必須)                   1ul

    Protein Kinase C (2.5ug/ml溶于PKC dilution bufer)     4ul

    去離子水使終體積為                  25ul


    PKC陰性對照檢測(不加PKC)

    PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer         5ul

    PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)          5ul

    PKC Activator 5XSolution,超聲處理的     5ul

    短肽保護液(非必須)                  1ul

    去離子水使終體積為               25ul


    7.在0時間點,把--支管子從冰上移到30°C水浴中孵育2分鐘。然后加入樣品或蛋白激酶C在30°C再孵育30分鐘。

    8.把管子放進開水浴或95°C加熱塊10分鐘以終止反應(yīng)。在凝膠電泳前把樣品--直避光存放在4°C或-20°C。

    9.把樣品上樣到膠上之前,往每個樣品中加進1ul的80%甘油,以確保樣品保留在上樣孔中(說明書第II.F部分)。

    10.每孔點樣10ul,在0. 8%瓊脂糖凝膠上以100V電泳15分鐘分開樣品,拍照。


    檢測結(jié)果:

    說明:后面2組泳道“陽性(PC)"和“陰性(NC)"為試劑盒自帶系統(tǒng)對照。

    注:陽性條帶以Gel pro4版凝膠光密度分析軟件進行分析,測其IOD (integrated optical density)累積光密度參考值。按照百分比例計算PKC活性百分比

    (以陽性對照I0D值為100,其余各組的PKC+ p-PKC總和為100分配IOD數(shù)值)


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