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    兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT實(shí)驗(yàn)方法
    點(diǎn)擊次數(shù):1981 更新時(shí)間:2015-12-15

     

    兔腫瘤組織巨噬細(xì)胞分離液KIT實(shí)驗(yàn)方法

     

    【產(chǎn)品規(guī)格】

     

    2×200ml/Kit

     

    【產(chǎn)品組成】

     

    為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:

     

     

     

     

     

    名稱

     

    產(chǎn)品編號

    規(guī)格

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    A

    試劑 A

     

     

     

    200ml

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    B

    試劑 C

     

     

     

    200ml

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    C

    樣本稀釋液(贈品)

     

    2010C1119

    200ml

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    D

    清洗液(贈品)

     

    2010X1118

    200ml

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    E

    F 液(贈品)

     

    F2013TBD

    200ml

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    F

    說明書

     

     

     

    1

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】

     

     

     

     

     

    A 適用儀器

     

     

     

     

     

     

    zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

     

     

     

     

    B 耗材

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    產(chǎn)品名稱

     

    產(chǎn)品貨號

     

    產(chǎn)地

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    15ml 離心管散裝

     

    339650

     

    美國 NUNC

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    15ml 離心管架裝

     

    339651

     

    美國 NUNC

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    50ml 離心管散裝

     

    339652

     

    美國 NUNC

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    50ml 離心管架裝

     

    339653

     

    美國 NUNC

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    無菌膠頭滴管或塑料滴管

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    【檢驗(yàn)方法】

     

     

     

     

     

     

    全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。

     

    1. 首先制備組織單細(xì)胞懸液,制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。

     

    1. 取一支 15ml 離心管,先加入 3ml 試劑 A 后加入 2ml 試劑 C,制成梯度界面。

     

    1. 用吸管小心吸取組織單細(xì)胞懸液加于分離液液面上,400-550g,離心 20-30min。(注: 根據(jù)組織單細(xì)胞懸液量確定離心條件,組織單細(xì)胞懸液量越大,離心力越大,離心時(shí)間 越長,具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果)。

     

     

    1. 離心后,此時(shí)離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層。

     

    1. 用吸管小心吸取上層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中,向離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細(xì)胞。

     

    1. 250g,離心 10min

     

    1. 棄上清。

     

    1. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細(xì)胞。

     

    1. 250g,離心 10min。

     

    1. 重復(fù) 7、8、9,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

     

    1. 差異貼壁法純化細(xì)胞 (1)用巨噬細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(產(chǎn)品編號:CTBD2015MAC)或巨噬細(xì)胞*培養(yǎng)基 (產(chǎn)品編號:HCTBD2015MAC)以 1.5-3×106 個(gè)/ml 的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次 性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,放于 37二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

     

    22-4 小時(shí)內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。 (310-24 小時(shí)內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。 (4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

     

    注:

     

    1. 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或 2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。

     

    1. *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。

     

    1. 由于每種細(xì)胞的貼壁時(shí)間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,此法成

     

    本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰

     

    性分選。

     

    【注意事項(xiàng)】

     

    1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,zui 好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),樣品存放時(shí)間越長,細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后 分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

     

    1. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。

     

    1. 吸取過多的乳白色細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的

     

     

     

    粒細(xì)胞數(shù)量增加。

     

    1. 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時(shí),分離效果更佳。

     

    1. 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低,請以尋求幫助,具體詳 見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

     

    【儲存條件及有效期】

     

    18-25保存,有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟

     

    封后置常溫保存。如 4保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。

     

    【參考值(參考范圍)】

     

    本實(shí)驗(yàn)巨噬細(xì)胞提取率大于 80%。

     

    下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

     

     

    紅細(xì)胞

     

    白細(xì)胞

     

    血小板

     

     

     

     

     

     

     

     

    4.0-10.0)×109

     

    含量(個(gè)/L

    4.0-5.5)×1012

    中性粒細(xì)胞

    淋巴細(xì)胞

    單核細(xì)胞

    1.0-3.0)×1011

     

     

    50%-70%

    20%-40%

    3%-8%

     

     

     

     

     

     

     

     

    【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】

     

    1. 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

     

    1. 所獲得巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

     

    1. 所獲得巨噬細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

     

    1. 所獲得巨噬細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù) C.原位雜交技術(shù)

     

    D.PCR 技術(shù)

     

    注:上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索細(xì)胞分離、

     

    純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊,并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。

     

    【可能存在的問題及解決方法】

     

    1.    由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:

     

    出現(xiàn)情況

    出現(xiàn)原因

     

    建議解決方案

     

     

     

     

     

    離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層

    轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短

    適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

     

     

     

     

     

    離心后目的細(xì)胞存在于分離液中

    轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    離心后白環(huán)層彌散

    細(xì)胞密度過大

    調(diào)整細(xì)胞密度

     

     

     

     

    離心后白環(huán)層太淺或看不見

    細(xì)胞密度過小

     

     

     

     

     

     

     

    1. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),恒定離 心時(shí)間,對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

     

    1. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

     

    注:在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí),離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),直至達(dá)到分離效果,

     

    離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。

    滬公網(wǎng)安備 31011802001676號

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