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    馬鈴薯Y病毒(PVY)ELISA試劑盒說明書
    點(diǎn)擊次數(shù):780 更新時(shí)間:2015-07-13

    馬鈴薯Y病毒(PVY)酶聯(lián)免疫分析(ELISA

    試劑盒使用說明書

    本試劑僅供研究使用       目的:本試劑盒用于檢測(cè)馬鈴薯組織,細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣本中Y病毒(PVY)水平。

    實(shí)驗(yàn)原理

      本試劑盒用雙抗夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)測(cè)定標(biāo)本馬鈴薯Y病毒(PVY)。用純化的馬鈴薯Y病毒(PVY)抗體包被微孔板,制成固相抗,可與樣品中馬鈴薯Y病毒(PVY)相結(jié)合經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的馬鈴薯Y病毒(PVY)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標(biāo)本中馬鈴薯Y病毒(PVY)的存在與否。


    試劑盒組成

    試劑盒組成

    48孔配置

    96孔配置

    保存

    說明書

    1份

    1份


    封板膜

    2片(48)

    2片(96)


    密封袋

    1個(gè)

    1個(gè)


    酶標(biāo)包被板

    1×48

    1×96

    2-8℃保存

    陰性對(duì)照

    0.5ml×1瓶

    0.5ml×1瓶

    2-8℃保存

    陽性對(duì)照

    0.5ml×1瓶

    0.5ml×1瓶

    2-8℃保存

    酶標(biāo)試劑

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    樣品稀釋液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    顯色劑A液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    顯色劑B液

    3 ml×1瓶

    6 ml×1瓶

    2-8℃保存

    終止液

    3ml×1瓶

    6ml×1瓶

    2-8℃保存

    濃縮洗滌液

    (20ml×20倍)×1瓶

    (20ml×30倍)×1瓶

    2-8℃保存


    樣本處理及要求

    1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

    2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

    3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

    4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測(cè)分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

    5. 組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),其余冷凍備用。

    6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

    7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。


    操作步驟

    • 編號(hào):將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,其余各步操作相同)
    • 加樣:分別在陰、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽性對(duì)照50μl。然后在待測(cè)樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測(cè)樣品10μl。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻,
    • 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
    • 配液:將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
    • 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
    • 加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,空白孔除外。 
    • 溫育:操作同3。
    • 洗滌:操作同5。
    • 顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘
    • 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)
    • 測(cè)定:以空白空調(diào)零,450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值) 測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。


    結(jié)果判定:

      試驗(yàn)有效性:陽性對(duì)照孔平均值1.00; 陰性對(duì)照平均值0.10

      臨界值(CUT OFF)計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15

      陰性判定:樣品OD值< 臨界值(CUT OFF)者為馬鈴薯Y病毒(PVY)陰性

      陽性判定:樣品OD值 臨界值(CUT OFF)者為馬鈴薯Y病毒(PVY)陽性

    注意事項(xiàng)

    1.操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

    2.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標(biāo)包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

    3.濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

    • 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    5.底物請(qǐng)避光保存。

    6.試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn),使用雙波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí),參考波長(zhǎng)為630nm

    7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,使用時(shí)必須注意安全。


    保存條件及有效期

    1.試劑盒保存:;2-8

    2.有效期:6個(gè)月

    滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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