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    流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟
    點(diǎn)擊次數(shù):284 更新時(shí)間:2025-05-27

    流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)操作步驟

     

    流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry, FCM)是利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的一種單細(xì)胞定量分析和分選技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)是單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、激光和電子計(jì)算機(jī)科學(xué)等高度發(fā)展及綜合利用的高技術(shù)產(chǎn)物,它能有效地從單細(xì)胞水平區(qū)分異質(zhì)性細(xì)胞群體,檢測(cè)對(duì)象包括但不限于懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞或從實(shí)體組織分離的單細(xì)胞懸液和其他生物顆粒。

     

    一、細(xì)胞表面染色步驟

    1.細(xì)胞準(zhǔn)備:

    1.1 采集全血或組織(脾,淋巴結(jié),胸腺和骨髓等),用細(xì)胞染色buffer(或PBS)制成單細(xì)胞懸液。對(duì)于體外刺激的細(xì)胞,直接將刺激后的細(xì)胞懸浮在細(xì)胞染色buffer(或PBS)中,然后進(jìn)行第2步。

    1.2 加滿細(xì)胞染色buffer(或PBS, 1000 rpm 離心細(xì)胞懸液5分鐘,棄掉上清。

     

    2. 紅細(xì)胞裂解:

    2.1 如果需要裂解紅細(xì)胞(如脾臟),將10×紅細(xì)胞裂解液(RBC)用H2O稀釋到1×,放置到室溫。將細(xì)胞重懸于3 mL 1 × RBC中,室溫孵育5分鐘。

    2.2 加入10 mL細(xì)胞染色buffer(或PBS)終止紅細(xì)胞裂解,1000 rpm離心細(xì)胞懸液5分鐘,棄掉上清。

    2.3 重復(fù)洗滌一次,同步驟1.2。

    2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù),用細(xì)胞染色buffer(或PBS)將細(xì)胞制成1×107 /mL懸液。將100 μL細(xì)胞懸液加入流式管中備用。

     

    3. 封閉Fc受體:

            封閉Fc受體能減少染色過(guò)程中的非特異性染色。小鼠中,純化的CD16/CD32單抗能和FcγR/Ⅱ結(jié)合,封閉非特異性染色,可加入5-10 μg/mLAnti-Mouse CD16/32單抗100 μL,冰上孵育10分鐘。對(duì)于人和大鼠,可直接使用過(guò)量的與熒光抗體相同來(lái)源和亞型不相關(guān)的純化Ig或者血清進(jìn)行阻斷。

     

    4. 細(xì)胞染色:

    4.1 按照說(shuō)明書的推薦用量加入熒光標(biāo)記的抗體,混勻后置于冰上,避光孵育30分鐘。

    4.2 加入5 mL FACs buffer (PBS) 重懸細(xì)胞,1000 rpm離心細(xì)胞懸液5分鐘,棄掉上清。

    4.3 加入0.5 mL FACs buffer(PBS)重懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。

     

    注意事項(xiàng)

    1. 在抗體使用之前,快速離心一下,使之聚集到管的底部。

    2. 熒光標(biāo)記的抗體應(yīng)該避光4℃保存,不要冷凍。

    3. 當(dāng)染色的時(shí)候,固定或延遲分析可能降低某些抗體的熒光信號(hào)。為了得到更好的結(jié)果,染色后應(yīng)該馬上分析。

     

    二、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色步驟

    1. 細(xì)胞準(zhǔn)備:

    1.1 收集細(xì)胞,用細(xì)胞染色buffer(或PBS)制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度約為1 × 107/mL。

    1.2  如需裂解紅細(xì)胞,將紅細(xì)胞裂解液(RBC)稀釋至1×,并平衡至室溫,用適量的1×紅細(xì)胞裂解液將細(xì)胞懸起,室溫避光孵育10分鐘;加入細(xì)胞染色buffer(或PBS)終止裂解,1000 rpm離心5分鐘,棄去上清。加入細(xì)胞染色buffer(或PBS)重復(fù)洗滌一次,調(diào)整細(xì)胞濃度約為1 × 107/mL。

    1.3 100 μL細(xì)胞/管(約1 × 106細(xì)胞),分別加到已經(jīng)標(biāo)記好的流式管底部。

     

     

    2. 固定:

    2.1 如需要表面染色,則依照“細(xì)胞表面染色步驟"選用適宜抗體進(jìn)行表面染色。然后用稀釋至1×的細(xì)胞固定/破膜液(Fixation/Permeabilization buffer),將流式管中的細(xì)胞懸起,室溫避光孵育30分鐘。

    2.2 1000 rpm離心5分鐘,棄去上清。

     

     

    3. 破膜:

    3.1 用稀釋至1×細(xì)胞破膜buffer將固定過(guò)的細(xì)胞懸起,1000 rpm離心力離心5分鐘,棄去上清。

    3.2 重復(fù)洗一次,1000 rpm離心5分鐘,棄去上清。

    3.3 加入1 mL 1×細(xì)胞破膜buffer4℃避光孵育30分鐘;1000 rpm離心5分鐘,棄去上清。

     

     

    4. 胞內(nèi)染色:

    4.1 100 μL 1×細(xì)胞破膜buffer重懸細(xì)胞,加入相應(yīng)的抗體,混勻,4℃避光孵育至少30分鐘。

    4.2 加入2 mL 1×細(xì)胞破膜buffer懸起細(xì)胞,1000 rpm離心5分鐘,棄去上清。

    4.3 加入2 mL細(xì)胞染色buffer(或PBS)懸起細(xì)胞,1000 rpm離心5分鐘,棄去上清。

    4.4 加入0.5 mL細(xì)胞染色buffer(或PBS)重懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)和分析。

     

    注意事項(xiàng)

    1. 同一個(gè)細(xì)胞同時(shí)做細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的蛋白,建議先做細(xì)胞表面染色,再固定、破膜。

    2. 細(xì)胞內(nèi)染色推薦使用同型對(duì)照。

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