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ELISA測(cè)定的常用模式--間接法測(cè)抗體
點(diǎn)擊次數(shù)：1628 更新時(shí)間：2012-07-30
基本方法的操作如下:
1．將病原體的抗原在碳酸鹽緩沖液中4~C過(guò)夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
2．加入含待測(cè)抗體的臨床樣本如血清等，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，待測(cè)抗體就會(huì)與固陽(yáng)上特異抗原反應(yīng)而吸附于固相上。
3．加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，在固相上即形成固相抗原—待測(cè)抗體—酶標(biāo)二抗復(fù)合物。
4．加入酶底物，溫育顯色測(cè)定（圖2—6）。
間接法測(cè)抗體在目前應(yīng)用zui多的是丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）、人免疫缺陷病毒抗體（抗HIV）以及梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定。從上述的測(cè)定模式可見，間接法測(cè)抗體，嚴(yán)格地講，所測(cè)定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是由酶標(biāo)二抗體所決定的。
影響間接法測(cè)定抗體的一個(gè)較大的因素是包被抗原的純度。現(xiàn)在間接法測(cè)抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋體TpNl5，TpNl7，TpN47等。基因工程抗原在純化時(shí)應(yīng)盡量去除用來(lái)表達(dá)的宿主如大腸桿菌的抗原，以免由于機(jī)體存在對(duì)這種宿主抗原的抗體而引起假陽(yáng)性反應(yīng)。此外，由于機(jī)體的IgG類抗體濃度較高，其中絕大部分為機(jī)體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG，因此，為避免這些高濃度非特異IgG對(duì)固相的吸附所致的假陽(yáng)性反應(yīng)，通常需對(duì)待測(cè)樣本做一定程度的稀釋。
1．將病原體的抗原在碳酸鹽緩沖液中4~C過(guò)夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
2．加入含待測(cè)抗體的臨床樣本如血清等，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，待測(cè)抗體就會(huì)與固陽(yáng)上特異抗原反應(yīng)而吸附于固相上。
3．加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育一定時(shí)間后洗板；此時(shí)，在固相上即形成固相抗原—待測(cè)抗體—酶標(biāo)二抗復(fù)合物。
4．加入酶底物，溫育顯色測(cè)定（圖2—6）。
間接法測(cè)抗體在目前應(yīng)用zui多的是丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）、人免疫缺陷病毒抗體（抗HIV）以及梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定。從上述的測(cè)定模式可見，間接法測(cè)抗體，嚴(yán)格地講，所測(cè)定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是由酶標(biāo)二抗體所決定的。
影響間接法測(cè)定抗體的一個(gè)較大的因素是包被抗原的純度。現(xiàn)在間接法測(cè)抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原，如HCV的NS3，NS4，NS5，HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋體TpNl5，TpNl7，TpN47等。基因工程抗原在純化時(shí)應(yīng)盡量去除用來(lái)表達(dá)的宿主如大腸桿菌的抗原，以免由于機(jī)體存在對(duì)這種宿主抗原的抗體而引起假陽(yáng)性反應(yīng)。此外，由于機(jī)體的IgG類抗體濃度較高，其中絕大部分為機(jī)體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG，因此，為避免這些高濃度非特異IgG對(duì)固相的吸附所致的假陽(yáng)性反應(yīng)，通常需對(duì)待測(cè)樣本做一定程度的稀釋。
