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    Western blot 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
    點(diǎn)擊次數(shù):222 更新時(shí)間:2025-05-21

    Western blot 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

    1. 配膠時(shí),建議先加水, 再加Tris-HCL緩沖液,并且每加一種液體就混勻膠液。加入的TEMED有毒,務(wù)必在通風(fēng)櫥中操作, 并且加入后立即混勻、灌膠。丙烯酰胺未聚合的單體有神經(jīng)毒性, 能夠經(jīng)皮膚吸收, 需戴手套操作。

    2. AP作為催化劑能夠提供氧自由基促使丙烯酰胺單體聚合, TEMED作為加速劑能夠促進(jìn)AP釋放氧自由基,加速丙烯酰胺單體的聚合。空氣溫度較低時(shí)稍稍多加TEMED可加快膠的凝固速度,但要確保AP未變質(zhì),否則無(wú)效。

    3. AP應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用, 否則變質(zhì)會(huì)導(dǎo)致膠不聚合。另外, TEMED添加過(guò)量會(huì)使膠凝得過(guò)快并且孔徑大小不一,影響蛋白的電泳,甚至可能燒膠。

    4. 電泳內(nèi)槽中應(yīng)加入新鮮的電泳液, 并且應(yīng)先拔梳子再安裝入電泳槽, 添加電泳液。這樣能夠沖洗掉各孔中碎膠, 確保電泳時(shí)條帶平直。

    5. 建議兩邊加入預(yù)染的Protein Marker,方便觀察不同KDa蛋白的分離情況,也方便后續(xù)的裁膜。

    6. 電轉(zhuǎn)液中一般需加入甲醇或乙醇, 而電轉(zhuǎn)時(shí)的放熱會(huì)加速醇類的揮發(fā)進(jìn)而影響下一次重復(fù)使用時(shí)的電轉(zhuǎn)效果。重復(fù)使用電轉(zhuǎn)液時(shí)應(yīng)考慮到醇類的揮發(fā)而適當(dāng)延長(zhǎng)電轉(zhuǎn)時(shí)間, 最好是每次電轉(zhuǎn)時(shí)都使用新的電轉(zhuǎn)液。不同KDa的蛋白電轉(zhuǎn)的條件不同, 所以可以針對(duì)目的蛋白進(jìn)行切膠, 然后在不同條件下電轉(zhuǎn)。

    7. 蓋上PVDF膜后, 不要再輕易移動(dòng), 否則條帶會(huì)模糊。兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會(huì)發(fā)生短路,蛋白會(huì)轉(zhuǎn)不過(guò)來(lái)。

    8. 封閉常用脫脂奶粉或BSA,建議建議做磷酸化蛋白的western時(shí)使用BSA(牛血清蛋白) 作為封閉液。奶粉含有酪蛋白(一種磷酸化蛋白),如果用奶粉,有可能出現(xiàn)背景深的現(xiàn)象。并且脫脂奶粉含磷酸酶, 磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化, 用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時(shí)會(huì)受到影響。

    9. 一抗在四度孵育時(shí)能夠延緩抗體的衰減速度, 提高重復(fù)利用的次數(shù)。建議嚴(yán)格按照要求進(jìn)行洗膜, 不要輕易減少洗膜的次數(shù)和時(shí)間。Tween20作為一種非離子表面活性劑, 能夠減少非特異性的抗體結(jié)合, 降低背景。所以如果曝光后發(fā)現(xiàn)背景高,可以將1XPBST/TBSTTween200.05%提高到0.5%,并且增加洗膜次數(shù)。

    10. 曝光時(shí)盡量將目標(biāo)蛋白和內(nèi)參一起曝光, 便于比較。如果使用傳統(tǒng)的壓片曝光, 可以壓兩張甚至更多的片子并折角, 折角可以確定方向, 增加壓片數(shù)量可以控制曝光強(qiáng)度。離膜最近的片子記錄亮度低的蛋白條帶的情況, 離膜遠(yuǎn)的蛋白可以保證亮度強(qiáng)的蛋白不過(guò)曝。

    11. 曝光時(shí)多使用ECL發(fā)光試劑盒, 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型試劑以增加亮度, 而內(nèi)參等含量較多的蛋白則應(yīng)使用普通的ECL發(fā)光試劑防止過(guò)亮,阻礙曝光。

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