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    牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
    點(diǎn)擊次數(shù):633 更新時間:2024-07-18

    牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法

    【產(chǎn)品名稱】

    通用名稱:牛肺炎(CBP)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

     

    【包裝規(guī)格】50T/盒

                                                                        

    【預(yù)期用途】

    牛傳染性胸膜肺炎又稱牛肺疫,是由絲狀支原體引起的一種急性或慢性、接觸性傳染病。以肺小葉間淋巴管漿液性炎癥,小葉間組織漿液性纖維素性浸潤,肺實(shí)質(zhì)纖維蛋白性壞死性炎癥,繼以患病肺部出現(xiàn)貧血性壞死,常伴有漿液性、纖維素性胸膜炎為特征。本試劑盒適用于檢測呼吸道、肺部等樣本中的牛肺炎,用于牛肺炎感染的輔助診斷。

     

    【檢驗(yàn)原理】

    本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時熒光PCR技術(shù),設(shè)計一對牛肺炎特異性引物,結(jié)合一條特異性探針,用熒光PCR技術(shù)對牛肺炎的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

     

    【試劑組成】

         

      規(guī)      

    CBP酶液

           25μL×1管

    CBP反應(yīng)液

          975uL×1管

    CBP陽性質(zhì)控品

          50μL ×1管

    陰性質(zhì)控品

         50μL ×1管

    說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

     

    【儲存條件及有效期】

    -20℃±5℃,避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融不超過5次,有效期12個月。

     

    適用儀器

    ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

     

    【標(biāo)本采集】

        疑似患病牲畜取呼吸道樣本或胸、肺部樣本進(jìn)行檢測。

     

    【保存和運(yùn)輸】

    上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用2~8℃冰袋運(yùn)輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

     

    使用方法

    1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

    1.1 樣本前處理

    組織樣品:每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;分泌液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。

     

    1.2 DNA提取

    為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、有效、可靠,建議使用商品化的DNA 提取試劑盒進(jìn)行提取,嚴(yán)格按照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

     

    2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

    根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照;樣品每滿7份,多配制1份),每測試反應(yīng)體系配制如下表:

    試劑

    CBP反應(yīng)液

    酶液

    用量(樣本數(shù)為N)

    19.5μL

    0.5μL

     

    3. 加樣(樣本處理區(qū))

    將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

     

    4. PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

    4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);

    4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置為25μL;

    熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM檢測牛肺炎,淬滅通道(Quencher Dye)NONE,請勿選擇ROX參比熒光。

    4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

    步驟

    循環(huán)數(shù)

    溫度

    時間

    收集熒光信號

    1

    1 cycle

    95℃

    3min

    2

    40 cycles

    95

    15sec

    55℃

    30sec

     

     

    5. 結(jié)果分析判定

    5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

    設(shè)置Baseline和Threshold:一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

     

    5.2 結(jié)果判斷

    陽性:檢測通道Ct值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

    可疑檢測通道35.0<Ct值<38.0,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗(yàn),重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴(kuò)增曲線者為陽性,否則為陰性。

    陰性:樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

     

    6. 檢測方法的局限性

    樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān);

    樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

    陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

    病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

    不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

    試劑運(yùn)輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

    本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

     

    7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

    陰性質(zhì)控品:無明顯擴(kuò)增曲線且無Ct值顯示;

    陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤30;

    以上條件應(yīng)同時滿足,否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

     

    8. 性能指標(biāo)

    1)敏感性:內(nèi)控樣本敏感性為100%,綜合評價敏感性98%以上。最DI檢測限不低于1000copies/ml。

    2)特異性:100%。

    3)穩(wěn)定性:批內(nèi)及批間差異≤3%。

     

    注意事項(xiàng)

    所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

    試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完全混勻并短暫離心;

    反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

    反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

    使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

    樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

    實(shí)驗(yàn)完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

    試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則》進(jìn)行處理

    2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色十多年,是您值得信賴的科研合作伙伴!

    如果您受時間、試驗(yàn)條件等限制而無法完成您的課題研究,歡迎您與我們聯(lián)系。

     

    實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù):

     


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