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    小鼠凋亡誘導因子(AIF)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書
    點擊次數(shù):1818 更新時間:2012-02-24

      一、實驗原理
      
      本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中AIF水平。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入AIF抗原、生物素化的抗小鼠AIF抗體、HRP標記的親和素,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的AIF呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度。
      
      二、試劑盒組成及試劑配制
      

    試劑盒組成

    96孔配置

    標本的采集及保存

    每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,然后反復顛倒/搓動以助溶解,其濃度為20,000 pg/ml,做系列倍比稀釋后,分別稀釋10,000 pg/ml,5,000 pg/ml,2,500 pg/ml,1,250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,156 pg/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制10,000 pg/ml標準品:取0.5ml 20,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,其余濃度以此類推。

    6. 檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制。7. 檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

    濃洗滌液

    1×30ml/瓶

    酶聯(lián)板(Assay plate )

    一塊(96孔)

    標準品(Standard)

    2瓶(凍干品)

    樣品稀釋液(Sample Diluent)

    1×20ml/瓶

    檢測稀釋液B

    1×10ml

    檢測稀釋液A

    1×10ml

    覆膜

    5張

    底物溶液(TMB Substrate)

    1×10ml/瓶

    終止液(Stop Solution)

    1×10ml/瓶(2N H2SO4)

    說明書

    1份


      
      三、標本的采集及保存
      
      1.細胞培養(yǎng)物上清:請離心后收集上清,并將標本保存于-20℃,且應避免反復凍融。
      
      2.血清:標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000xg離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)吮痉庞?20℃保存,但應避免反復凍融。
      
      3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內(nèi)于2-8°C1000xg離心15分鐘,或?qū)吮痉庞?20℃保存,但應避免反復凍融。
      
      注:標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
      
      四、操作步驟
      

      實驗開始前,請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?,試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,用樣品稀釋液進行稀釋,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
      
      1.加樣:分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應120分鐘。
      
      為保證實驗結(jié)果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
      
      2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100ul(取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘。
      
      3.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
      
      4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液)100ul,37℃,60分鐘。
      
      5.溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
      
      6.依序每孔加底物溶液90ul,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
      
      7.依序每孔加終止溶液50ul,終止反應(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。
      
      8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。
      
      注:
      
      1.為防止樣品蒸發(fā),試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上覆膜或蓋。
      
      2.未使用完的酶標板或者試劑,請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液
      
      3.每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
      
      4.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,以保證檢測結(jié)果的準確性。
      
      五、洗板方法

      
      手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,重復此過程數(shù)次。
      
      六、自動洗板:如果有自動洗板機,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
      
      七、特異性
      
      本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠AIF,且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應。
      
      八、預期應用
      
      ELISA法定量測定小鼠血清、血漿或其它相關(guān)液體中凋亡誘導因子(AIF)含量。
      
      九、概述
      
      凋亡誘導因子(apoptosis-inducingfactor,AIF)是位于線粒體膜間隙的一種黃素蛋白。在凋亡信號刺激時,AIF分子從線粒體釋放到細胞漿,然后轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi),引起染色體核周邊凝集和DNA呈大片段斷裂,從而使細胞發(fā)生凋亡的特征性改變。AIF所誘導的細胞凋亡是獨立于caspases系統(tǒng)的另一條更原始和更保守的凋亡途徑,因而不受caspases抑制劑的抑制。凋亡與許多眼病的發(fā)生具有密切的關(guān)系。
      
      十、計算
      
      以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
      
      十一、注意事項
      
      1.洗滌過程非常重要,不充分的洗滌易造成假陽性。
      
      2.一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
      
      3.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。
      
      4.如標本中待測物質(zhì)含量過高,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
      
      5.在配制標準品、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,不能混淆。
      
      6.底物請避光保存。
      
      十二、說明
      
      1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
      
      2.小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標本/標準品,酶結(jié)合物或底物時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,將會導致不同的“預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,洗滌不充分將影響試驗結(jié)果。
      
      3.試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標簽上的標示為準。
      
      4.濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
      
      5.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
      
      6.中、英文說明書可能會有不一致之處,請以英文說明書為準。
      
      7.所有的樣品都應管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
      
      十三、有效期:6個月
      
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