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    鴨病毒性肝炎(DVh)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)
    點擊次數(shù):2320 更新時間:2012-01-11

    鴨病毒性肝炎(DVh)酶聯(lián)免疫分析(ELISA

    試劑盒使用說明書

    病毒性肝炎試劑盒用于檢測血清,血漿及相關(guān)液體樣本中病毒性肝炎(DVh)水平。

    實驗原理:

      本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定標本中鴨病毒性肝炎(DVh)。用純化的鴨病毒性肝炎(DVh)抗體包被微孔板,制成固相抗體,可與樣品中病毒性肝炎(DVh)相結(jié)合,經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標記的病毒性肝炎(DVh)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMBHRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),與CUTOFF值相比較,從而判定標本中鴨病毒性肝炎(DVh)的存在與否。

     

    試劑盒組成

    試劑盒組成

    48孔配置

    96孔配置

    保存

    說明書

    1

    1

     

    封板膜

    2片(48

    2片(96

     

    密封袋

    1

    1

     

    酶標包被板

    1×48

    1×96

    2-8℃保存

    陰性對照

    0.5ml×1

    0.5ml×1

    2-8℃保存

    陽性對照

    0.5ml×1

    0.5ml×1

    2-8℃保存

    酶標試劑

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    樣品稀釋液

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    顯色劑A

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    顯色劑B

    3 ml×1

    6 ml×1

    2-8℃保存

    終止液

    3ml×1

    6ml×1

    2-8℃保存

    濃縮洗滌液

    20ml×20倍)×1

    20ml×30倍)×1

    2-8℃保存

     

    病毒性肝炎樣本處理及要求

    1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

    2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

    3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

    4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBSPH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

    5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBSPH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

    6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

    7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

     

    病毒性肝炎操作步驟:

    1.         編號:將樣品對應(yīng)微孔按序編號,每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)

    2.         加樣:分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,

    3.         溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

    4.         配液:將3048T20倍)倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

    5.         洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復(fù)5次,拍干。

    6.         加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。

    7.         溫育:操作同3。

    8.         洗滌:操作同5。

    9.         顯色:每孔先加入顯色劑A 50μl,再加入顯色劑B 50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘

    10.     終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。

    11.     測定:以空白空調(diào)零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

     

    結(jié)果判定:

      試驗有效性:陽性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

      臨界值(CUT OFF)計算:臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

      陰性判定:樣品OD< 臨界值(CUT OFF)者為病毒性肝炎(DVh)陰性

      陽性判定:樣品OD臨界值(CUT OFF)者為病毒性肝炎(DVh)陽性

    病毒性肝炎注意事項

    1.操作嚴格按照說明書進行,本試劑不同批號組分不得混用。

    2.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

    3.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

    4.  封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

    5.底物請避光保存。

    6.試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準,使用雙波長檢測時,參考波長為630nm

    7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸,使用時必須注意安全。

     

    保存條件及有效期

    1.試劑盒保存:;2-8

    2.有效期:6個月

     

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