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    MS2505蔗糖磷酸合成酶試劑盒說明書
    點擊次數:1349 更新時間:2021-05-25

    蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)試劑盒說明書

    微量法

    正式測定管前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

    測定意義

    蔗糖不僅是重要的光合產物,也是植物體內運輸的主要物質,還是碳水化合物的貯存形式之一。SPSEC 2.4.1.14)以果糖-6-磷酸為受體,形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系統(tǒng)看作是蔗糖合成的主要途徑。

    測定原理

    蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸,蔗糖磷酸與間苯二酚反應可呈現顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。

    需自備的的儀器和用品

    可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、離心機、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

    試劑的組成和配制

    提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑一:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;

    試劑二:1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑三:液體 2mL×1 瓶,4℃保存

    試劑四:液體 25mL×1 瓶,4℃保存;

    試劑五:液體 6mL×1 瓶,4℃保存;

    樣品測定的準備:

    按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

    測定步驟

    1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節(jié)波長至480nm,蒸餾水調零。

    2、樣本測定(在 EP 管中依次加入下列試劑):

    試劑名稱(μL)  

    測定管  

    對照管  

    標準管  

    空白管

    樣本  

    10  

    10

     

     

    蒸餾水  

     

    45  

    45  

    55

    試劑二  

     

     

    10

     

    試劑一  

    45

     

     

     

    混勻,25℃準確水浴 10min

    試劑三  

    15  

    15  

    15  

    15

    沸水浴中煮沸 10min 左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻

    試劑四  

    210  

    210  

    210  

    210

    試劑五  

    60  

    60  

    60  

    60

    混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測定各管吸光值。標準管和空白管只要做一管。每個測定管需要設一個對照管。

    SPS 活力單位的計算

    1、按照蛋白濃度計算

    單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。

    SPS 活性(μg /min/mg prot)= {C 標準管×V1×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管))÷(V1×Cpr)÷T=100×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

    2、按照樣本鮮重計算

    單位定義:每g組織每分鐘催化產生1μg蔗糖定義為一個酶活力單位。

    SPS 活性(μg /min/g 鮮重) = {C 標準管×V1×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管))÷(W×V1÷V2)÷T=100×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W

    C 標準管:標準管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mLV2:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本鮮重,gT :反應時間:10min。

     

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