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    pBM16A Toposmart Cloning常見問題分析
    點(diǎn)擊次數(shù):1322 更新時(shí)間:2021-04-06

    pBM16A Toposmart Cloning Kit

     

    產(chǎn)品信息:

     

    組 成

    YCL071-01

    YCL071-02

    pBM16A Vector (20ng/ml )

    20ml

    20ml×3

    10×Toposmart

    20ml

    20ml×3

    Control Insert

    5ml

    5ml

    M13F Primer

    0.1OD

    0.1OD×3

    M13R Primer

    0.1OD

    0.1OD×3

     

    保存條件:-20℃保存,有效期一年。產(chǎn)品介紹:
     
    pBM16A Toposmart克隆試劑盒利用痘苗病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topoisomerase I)的切割再連接的特點(diǎn)將片段克隆到載體中。不僅適用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion 和Q5等高保真DNA聚合酶擴(kuò)增的平末端PCR產(chǎn)物,也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶擴(kuò)增的帶A尾的PCR產(chǎn)物。試劑盒中的pBM16A載體為線性化的質(zhì)粒??梢杂靡飳?duì)M13F和M13R進(jìn)行菌落PCR鑒定陽性克隆。
     
    產(chǎn)品特點(diǎn):
     
    (1)連接反應(yīng)僅需5 分鐘。
     
    (2)適用于平末端PCR產(chǎn)物和帶A尾的PCR產(chǎn)物。
     
    (3)載體采用了新的制備工藝,無需藍(lán)白斑篩選。
     
    (4)克隆位點(diǎn)兩旁都有Smal和EcoR V酶切位點(diǎn),適合單酶切鑒定。
     
    (5)載體具有氨芐青霉素抗性。
     
    操作步驟:
     
    1.連接反應(yīng)
     
    按下表,在一個(gè)0.2ml PCR 管中依次加入
     

    成分

    體積

    DNA *#片段

    0.5-8µl

    pBM16A Topo載體

    1ml

    10×Toposmart

    1ml

    補(bǔ)水至總體積

    10ml

     
     
    加完試劑后,輕輕混勻低速離心,使溶液集中在管底。
     
    注意:此步驟不要在低溫條件下(冰水浴)上操作。
     
    2.反應(yīng)溫度及片段要求
     
    室溫下(20-30℃)放置 0-5 分鐘,然后將離心管放置在冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。
     
    注意:DNA *#片段的用量見下表
     
     

    片段大?。?/span>bp

    建議用量(ng

    100-1000

    20-50

    1000-2000

    50-100

    2000-5000

    100-200

     
    室溫下(20-30℃)反應(yīng)時(shí)間 5-30 分鐘,如果室溫較低,推薦使用 PCR 儀器控制溫度??梢栽O(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測僅有很銳利明亮的條帶,無引物二聚體和非特異性條帶存在,可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進(jìn)行克隆。
     
    3.陽性對(duì)照反應(yīng)
     
    取1µl 試劑盒提供的1kb長度的對(duì)照片段LacZ 基因α肽片段進(jìn)行克隆,轉(zhuǎn)化具有α 互補(bǔ)功能的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(如 DH5α,*0,Mach1-T1 等)。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上,次日藍(lán)色菌落為陽性克隆,說明有片段插入,白色菌落為空載體。
     
    4.轉(zhuǎn)化
     
    1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中,輕輕混勻,冰浴2-30 分鐘。
     
    2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。
     
    3.立刻置于冰水浴中2 分鐘。
     
    加入300-500µl 無菌的不含抗生素的SOC 或LB,37℃,200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘。
     
    注:小于 2kb 片段可以不復(fù)蘇,直接涂平板。
     
    4.吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落,可以先4000rpm 離心1 分鐘,去掉部分上清,用移液器輕吹菌體,充分懸浮菌液,取全部菌液涂布,然后 37℃培養(yǎng)過夜(12-16 小時(shí))。
     
    5.陽性重組子的鑒定菌落 PCR
     
    (1)菌落PCR方法鑒定陽性克隆
     
    ① 用10l吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中,吹打混合。
     
    ② 25l PCR反應(yīng)體系:取2μl細(xì)菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各
     
    1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
     
    ③PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5分鐘(裂解細(xì)胞,失活核酸酶),94℃變性10秒鐘,55℃退火10秒鐘,72℃延伸( 根據(jù)片段的大小決定延伸時(shí)間,通常每1min/1kb)X秒,30個(gè)循環(huán),72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果,有強(qiáng)烈的明顯條帶的克隆為重組體,與插入片段大小相近(M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè),所以PCR擴(kuò)增出的DNA的長度比插入片段大138bp) 可視為陽性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時(shí)一定要設(shè)立一個(gè)不加菌液的陰性對(duì)照。
     
    (2)測序:用M13F、M13R通用引物對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。
     
    pBM16A載體圖譜
     
    常見問題分析
     
    重組子克隆菌少,或陽性率低:
     
    (1)感受態(tài)效率低,使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細(xì)胞
     
    (2)連接反應(yīng)在低溫下(如放碎冰上)操作,應(yīng)該在室溫下操作。
     
    (3)PCR 片段加入量太多或太少,按照推薦量加入。
     
    (4)PCR 純度低,重新擴(kuò)增或重新純化PCR 產(chǎn)物。
     
    (5)PCR 質(zhì)量低,切膠時(shí)在紫外下照射時(shí)間長,需重新制備。
     
    (6)PCR 擴(kuò)增結(jié)束后,應(yīng)該再延伸 5-10 分鐘,確保片段延伸*。
     
    (7)轉(zhuǎn)化后沒有復(fù)蘇培養(yǎng),可以加入 SOC 或LB,培養(yǎng) 60 分鐘。
     
    (8)克隆基因可能對(duì)宿主菌有毒性,比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因, 某些啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列基因,或含有倒置或串聯(lián)重復(fù)序列的基因,選用室溫過夜培養(yǎng)平板。
     
    載體序列:
     
    >pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC
     
    本產(chǎn)品僅供研究不用于臨床診斷
     

     

    實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):

     

    免疫組化IHC染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    細(xì)胞、組織TUNEL凋亡染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    試劑盒免費(fèi)代檢測

    實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目

     

    透射電鏡服務(wù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    石蠟/冰凍切片TUNEL凋亡

    核仁組成區(qū)嗜銀-AGNOR染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    免疫共沉淀(CHIRP)實(shí)驗(yàn)

    RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)代做

    酶聯(lián)免疫(ELISA)技術(shù)服務(wù)

    雞傳染性法氏囊病病毒VP2抗體診斷試劑盒

    喹諾酮類快速檢測試劑盒

    組織芯片/微陣列定制技術(shù)服務(wù)

     

    染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

     

    多因子液相芯片技術(shù)(Luminex)實(shí)驗(yàn)

    免疫細(xì)胞化學(xué)ICC實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    ATP/ADP檢測實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    蛋白雙向(2-D)電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    蛋白相互作用分析

    堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    PKC活性檢測實(shí)驗(yàn)

    非標(biāo)定量實(shí)驗(yàn)

    (Label-free)

     

    DIGE技術(shù)實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    端粒酶活性檢測實(shí)驗(yàn)

    細(xì)胞生長曲線的測定

    掃描電鏡服務(wù)

    NF-KB p65活性檢測實(shí)驗(yàn)

     

    慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)服務(wù)

    滬公網(wǎng)安備 31011802001676號(hào)

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