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2.反應(yīng)溫度及片段要求

 

室溫下（20-30℃）放置 0-5 分鐘，然后將離心管放置在冰上。如當(dāng)天不進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。請(qǐng)將連接產(chǎn)物置于-20℃保存。

 

注意：DNA *#片段的用量見(jiàn)下表

 

 

 

室溫下（20-30℃）反應(yīng)時(shí)間 5-30 分鐘，如果室溫較低，推薦使用 PCR 儀器控制溫度?？梢栽O(shè)置 25℃反應(yīng) 5 分鐘。如果 PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)僅有很銳利明亮的條帶，無(wú)引物二聚體和非特異性條帶存在，可直接取 0.5-1µl PCR 產(chǎn)物原液進(jìn)行克隆。

 

3.陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)

 

取1µl 試劑盒提供的1kb長(zhǎng)度的對(duì)照片段LacZ 基因α肽片段進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化具有α 互補(bǔ)功能的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（如 DH5α,*0,Mach1-T1 等）。菌液涂布在含有IPTG,X-gal 的LB 氨芐平板上，次日藍(lán)色菌落為陽(yáng)性克隆，說(shuō)明有片段插入，白色菌落為空載體。

 

4.轉(zhuǎn)化

 

1.取5µl 連接產(chǎn)物到50-100µl 剛剛?cè)诨母惺軕B(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴2-30 分鐘。

 

2.42℃水浴中熱擊30 秒鐘。

 

3.立刻置于冰水浴中2 分鐘。

 

加入300-500µl 無(wú)菌的不含抗生素的SOC 或LB，37℃，200-250rpm 振蕩培養(yǎng)60 分鐘。

 

注：小于 2kb 片段可以不復(fù)蘇，直接涂平板。

 

4.吸取200µl 菌液涂布。為了得到更多的菌落，可以先4000rpm 離心1 分鐘，去掉部分上清，用移液器輕吹菌體，充分懸浮菌液，取全部菌液涂布，然后 37℃培養(yǎng)過(guò)夜（12-16 小時(shí)）。

 

5.陽(yáng)性重組子的鑒定菌落 PCR

 

（1）菌落PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆

 

① 用10l吸頭挑選克隆至預(yù)先加有10μl無(wú)菌水或LB培養(yǎng)基的PCR管中，吹打混合。

 

② 25l PCR反應(yīng)體系：取2μl細(xì)菌懸液為模板、加入5μM 濃度的M13F/M13R各

 

1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

 

③PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶），94℃變性10秒鐘，55℃退火10秒鐘，72℃延伸（ 根據(jù)片段的大小決定延伸時(shí)間，通常每1min/1kb）X秒，30個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5分鐘。1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，有強(qiáng)烈的明顯條帶的克隆為重組體，與插入片段大小相近（M13F/M13R 引物在克隆位置的兩側(cè)，所以PCR擴(kuò)增出的DNA的長(zhǎng)度比插入片段大138bp） 可視為陽(yáng)性克隆。菌落PCR方法鑒定重組子時(shí)一定要設(shè)立一個(gè)不加菌液的陰性對(duì)照。

 

（2）測(cè)序：用M13F、M13R通用引物對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。

 

pBM16A載體圖譜

 

常見(jiàn)問(wèn)題分析

 

重組子克隆菌少，或陽(yáng)性率低：

 

(1)感受態(tài)效率低，使用轉(zhuǎn)化效率>5×107cfu/µg 的感受態(tài)細(xì)胞

 

(2)連接反應(yīng)在低溫下（如放碎冰上）操作，應(yīng)該在室溫下操作。

 

(3)PCR 片段加入量太多或太少，按照推薦量加入。

 

(4)PCR 純度低，重新擴(kuò)增或重新純化PCR 產(chǎn)物。

 

(5)PCR 質(zhì)量低，切膠時(shí)在紫外下照射時(shí)間長(zhǎng)，需重新制備。

 

(6)PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，應(yīng)該再延伸 5-10 分鐘，確保片段延伸*。

 

(7)轉(zhuǎn)化后沒(méi)有復(fù)蘇培養(yǎng)，可以加入 SOC 或LB，培養(yǎng) 60 分鐘。

 

(8)克隆基因可能對(duì)宿主菌有毒性，比如某些編碼膜蛋白和 DNA 結(jié)合蛋白的基因， 某些啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)序列基因，或含有倒置或串聯(lián)重復(fù)序列的基因，選用室溫過(guò)夜培養(yǎng)平板。

 

載體序列：

 

>pBM16A Topo AGTGAGTTGATTGTGTAAAACGACGGCCAGTGTCTGAGGCTCGCTTCAGTCCTGATGCTTGATATCCCGGGCGT GTCGCCCTT$$$$AAGGGCGACACGCCCGGGATATCGCGTCTGCCTGAAGTCAATACTGACGATGGTCATAGCT GTTTCCTGTCCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCC AACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA AGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCACTTATTCCGTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTG CTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTG GATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGT TCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTC AGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGC AGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCT AACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCA TACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAA CTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCG CTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGCTCTCGCGGTATCATTG CAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGAT GAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAATGTAATCA CCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATC ACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGA AGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAG CGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGA CACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGA GTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAG TTACCTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTT GCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAGAAAGGCCCAC CCGTGAAGGTGAGCC

 

本產(chǎn)品僅供研究不用于臨床診斷