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    四環(huán)素快速檢測試劑盒說明書
    點擊次數(shù):1645 更新時間:2020-12-09

     

    四環(huán)素快速檢測試劑盒說明書

     

    一、原理

     

    本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物四環(huán)素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素抗體,加入酶標(biāo)記物后,用 TMB 底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物四環(huán)素的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物四環(huán)素的含量。

     

    二、試劑盒特性

     

    • 試劑盒靈敏度: 0.05ppb

     

    u

    孵育溫度:

    25

    u

    孵育時間:

    30min15min

     

    樣本檢測下限

     

     

    雞肉樣本:

     

    四環(huán)素 ···········································

    0.4ppb

    甲按胺四環(huán)素 ··································

    0.4ppb

    吡四環(huán)素 ········································

    0.4ppb

    金霉素  ········································

    0.4ppb

    脫甲基金霉素 ·································

    1.2ppb

    土霉素 ··········································

    0.8ppb

    強(qiáng)力霉素 ·······································

    1ppb

    豬肉、蜂蜜樣本:

     

    四環(huán)素 ··········································

    0.5ppb

    甲按胺四環(huán)素 ·································

    0.5ppb

    吡四環(huán)素 ······································

    0.5ppb

    金霉素 ·········································

    0.5ppb

    脫甲基金霉素 ································

    1.5ppb

    土霉素 ···········································

    1ppb

    強(qiáng)力霉素 ········································

    1.2ppb

     

    • 交叉反應(yīng)率

     

    四環(huán)素 ··········································  100%

     

    甲按胺四環(huán)素 ·································  125%

     

    吡四環(huán)素 ·······································

    110%

    金霉素 ···········································

    100%

    脫甲基金霉素 ···································

    35%

    土霉素 ············································

    58%

    強(qiáng)力霉素 ·········································

    45%

     

    • 樣本回收率

     

    雞肉、豬肉、蜂蜜 ····························  85±20%

     

    三、試劑盒組成

     

    1

    微量測試孔

    每條 8 孔,一板 12 條

     

     

     

     

    2

    標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液

    1ml

    黑色帽

    81ppb

     

     

     

     

    3

    高濃度標(biāo)準(zhǔn)品

    1ml

    黑色帽

    100ppb

     

     

     

     

    4

    酶標(biāo)記物

    7ml

    白色帽

     

     

     

     

    5

    抗體工作液

    7ml

    白色帽

     

     

     

     

    6

    底物 A 液

    7ml

    白色帽

     

     

     

     

    7

    底物 B 液

    7ml

    黑色帽

     

     

     

     

    8

    終止液

    7ml

    黃色帽

     

     

     

     

    9

    20X 濃縮洗滌液

    15ml

    白色帽

     

     

     

     

    10

    10X 樣本提取液

    50ml*2

    透明帽

     

     

     

     

    11

    標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液

    15ml*2

    藍(lán)色帽

     

     

     

     

     

    四、所用儀器、試劑

     

    具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量 0.01g)、恒溫箱

     

    微量移液器:單道 20200µl、單道 1001000µl、多道 30300 µl

     

    劑:甲醇

     

    五、樣本前處理步驟

     

    樣本處理前須知

     

    a)實驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。

     

    b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈, 

    必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實

    3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于

    驗結(jié)果。

    洗板的一致性,正確的洗板操作是 ELISA 測定

    u

    樣本前處理需配制:

    程序中的要點。

     

    配液 1

    樣本提取液 A

    4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜

     

     

    用去離子水450ml 與50ml 10X 樣本提取液

    蓋住微孔板。

     

     

     

    混勻或按 91 的比例按需配制( 10X

    u  操作步驟:

     

     

     

    樣本提取液有結(jié)晶,需溶解后在進(jìn)行稀

    1、從 28℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20

     

     

    )。

    25℃)平衡 30min 以上,注意每種液體試劑使

    配液 2

    樣本提取液 B

    用前均須搖勻。

     

     

     

    取甲醇 50ml 與 450ml 樣本提取液 A 混勻

    2、配制標(biāo)準(zhǔn)品

     

     

     

    或按 19 的比例按需配制。

    標(biāo)準(zhǔn)品 650µl 標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液(81ppb)用 950µl

    配液 3

    樣本提取液 C

    標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液稀釋

    4.05ppb

     

     

    取甲醇 100ml 與 270ml 樣本提取液 A 混勻

    標(biāo)準(zhǔn)品 5600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 6

     

     

    或按 1027 的比例按需配制。

    混合

    1.35ppb

    u

    樣本處理:

    標(biāo)準(zhǔn)品 4600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 5

    a)雞肉處理方法

    混合

    0.45ppb

    1、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中,

    標(biāo)準(zhǔn)品 3600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 4

     

    加入 8ml 樣本提取液 A(見配液 1,振蕩 3min,

    混合

    0.15ppb

     

    室溫 4000r/min 以上,離心 10min

    標(biāo)準(zhǔn)品 2600µl 標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液與 300µl 標(biāo)準(zhǔn)品 3

    2、取 50 上清液用于分析

    混合

    0.05ppb

     

    樣本稀釋倍數(shù): 8 倍

    標(biāo)準(zhǔn)品 1:標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶液

    0ppb

    b)豬肉處理方法

    3、取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放

    1、稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中,

    入自封袋,保存于 2-8℃。

     

     

    加入 10ml 樣本提取液 B(見配液 2,振蕩 3min,

    4、配液:將 15ml 濃縮洗滌液(20 倍濃縮)用去

     

    室溫 4000r/min 以上,離心 10min;

    離子水按照 119 稀釋(1 份濃縮洗滌液+19 份

    2、取 50 µl 上清液用于分析

    去離子水),或按所需用量配制洗滌液。

     

    樣本稀釋倍數(shù): 10 倍

    5、編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每

    c)蜂蜜處理方法

    個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和

    1、 稱取 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中,

    樣本孔所在的位置。

     

     

    加入10ml 樣本提取液C(見配液3,振蕩3min,

    6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中,然后加

     

    室溫 4000r/min 以上,離心 10min;

    加入酶標(biāo)記物 50µl/孔再加入抗體工作液 50µl/

    2、 取 50 µl 上清液用于分析

    孔,用蓋板膜封板,輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境

     

    樣本稀釋倍數(shù): 10 倍

    中反應(yīng) 30min。

     

     

    7、將孔內(nèi)液體甩干,用已稀釋的洗滌液 250µl/

    六、酶標(biāo)免疫分析程序:

    洗板 45 次,每次間隔 1530 秒,用吸水紙

    u

    測定前應(yīng)須知:

     

     

     

    1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

    拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺

     

     

     

     

     

    2025℃)。

    破)。

     

     

    8、顯色:加入底物 A  50µl/孔,再加入底物 B

     

     

    2、 使用之后立即將所有試劑放回 28℃。

     

     

    50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25℃環(huán)境中避光顯

     

     

     

     

     

     

     

    15min。

     

    9、測定:加入終止液 50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處(建議用雙波長 450/630n m 檢測,5min 內(nèi)讀數(shù)),測定每孔 OD 值。

     

    七、結(jié)果判定

     

    結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第 1 種方法,定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與其所含四環(huán)素量成負(fù)相關(guān)。

     

    1、粗略判定:

     

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3,樣本 2 的吸光度值為 1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:

     

    0ppb  2.2430.05ppb  1.816;0.15ppb  1.415; 0.45ppb  0.741.35ppb  0.313;4.05ppb  0.155。

     

    則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb4.05ppb;樣本 2

     

    的濃度范圍是 0.15ppb0.45ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實際濃度。

    2、定量分析

     

    1)百分吸光率的計算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第--個標(biāo)準(zhǔn)(0 標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以 100%,即

     

    B

    百分吸光率(%)= ×100%

    B0

     

    B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

     

    2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)

     

    品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中四環(huán)素實際濃度。

     

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

     

    八、 注意事項

     

    1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

    2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

    3、混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

    4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸,避免接觸皮膚。

    5、不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。

    6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時,表示試劑可能變質(zhì)。

    8、該試劑盒理想反應(yīng)溫度為 25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

     

    九、儲藏條件和保質(zhì)期

     

    1、儲藏條件:試劑盒于 2-8℃保存,不要冷凍。

    2、保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為 1 年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

     

    提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實驗結(jié)果,請放心使用。

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