HiFiScript快速去基因組cDNA 一鏈合成試劑盒
目錄號(hào)：K2582
保存條件：-20℃。
規(guī)格說明
Cat. No. | K2582-25 | K2582-100 |
Kit Size | 25 | 100 |
gDNA Eraser | 12.5 µl | 50 µl |
10×gDNA Eraser Buffer | 30 µl | 120ul |
HiFiScript，200 U/μl | 25ul | 100ul |
5×RT Buffer | 120ul | 500ul |
Primer Mix | 30ul | 120ul |
RNase-Free Water | 1ml | 2×1 ml |
本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及其他用途
操作步驟
將模板RNA在冰上解凍；試劑盒組分在室溫解凍后立刻置于冰上。使用前將每種溶
液渦旋振蕩混勻，并經(jīng)短暫離心后使用。
一、去除基因組DNA反應(yīng)
1．根據(jù)以下表格在冰上配制反應(yīng)體系，總體積為10 μl。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制預(yù)混體系，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中，后加入RNA樣品。
試劑 | 10 μl反應(yīng)體系 |
10×gDNA Eraser Buffer | 1 µl |
gDNA Eraser | 0.5 µl |
RNA Template | 10 pg-1 μg |
RNase-Free Water | up to 10 µl |
注意：1）如果總RNA量大于1 µg，請(qǐng)按比例擴(kuò)大反應(yīng)體系。若起始RNA的量小于50 ng，則建議加入RNA酶抑制劑（RNasin），該產(chǎn)品貨號(hào)為K0596。
2．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
3．42℃孵育2分鐘（室溫反應(yīng)時(shí)，可以延長(zhǎng)到30分鐘）。
4．反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。
二、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
1．根據(jù)以下表格在冰上配制反應(yīng)體系，反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行。為了保證反應(yīng)液配置的
準(zhǔn)確性，先按數(shù)+2的量配制成預(yù)混溶液，然后再分裝 10 μl到每個(gè)反應(yīng)管中，取配制的
預(yù)混液10 μl加入至已完成去基因組的步驟1反應(yīng)管中。
試劑 | 20μ反應(yīng)體系 |
步驟1反應(yīng)液 | 10ul |
HiFiScript，200 U/μl | 1ul |
Primer Mix | 1ul |
5×RT Buffer | 4ul |
RNase-Free Water | 4ul |
注意：1） 可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可使用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，建議20 μl 反應(yīng)體系
Oligo-dT Primer 50pmol，或Gene Specific Primer 2 pmol。
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
本產(chǎn)品是用于去除基因組DNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的試劑盒。該試劑盒在42℃，2 min即可
除去基因組DNA。同時(shí)由于反轉(zhuǎn)錄試劑中含有抑制gDNA Eraser的組分，經(jīng)過gDNA
Eraser處理后的樣品可以直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。本試劑盒配有新型高效反轉(zhuǎn)
錄酶HiFiScript，新穎突變位點(diǎn)大幅提升酶的轉(zhuǎn)錄活性，cDNA *一鏈合成的效率和產(chǎn)
量更高，可利用pg級(jí)的總RNA或mRNA合成cDNA*一鏈。如逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于下
游熒光定量檢測(cè)，可在42℃，15min完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本試劑盒適用于*一鏈 cDNA的
合成和后續(xù)的RT-PCR、RT-qPCR、以及全長(zhǎng)cDNA文庫的構(gòu)建等。
產(chǎn)品特點(diǎn)
1．快速去除基因組：含有去除基因組DNA的gDNA Eraser，只需 2 min即可除去基因
組DNA。
2．快速逆轉(zhuǎn)錄：15分鐘即可獲得熒光定量PCR模板cDNA*一鏈合成。
3．靈敏度高：可利用pg級(jí)總RNA或mRNA模板合成cDNA*一鏈。
4．高效的逆轉(zhuǎn)錄效率：新穎突變位點(diǎn)大幅提升酶活性能，獲得更高產(chǎn)量的cDNA。
注意事項(xiàng)
1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒?yàn)中的交叉污染，建議操作人
員帶kouzhao和一次性手套并經(jīng)常更換手套，使用專門的儀器和耗材。
2．逆轉(zhuǎn)錄體系配制在冰上進(jìn)行操作，防止RNA發(fā)生降解。試劑盒的酶使用后盡快置于
-20 ºC保存，并盡量避免反復(fù)凍融。
3．反應(yīng)體系可倍比放大，10 μl反應(yīng)體系可大使用1μg總RNA。
4．Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用
Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer。
5．若起始RNA的量小于50 ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提
供，如需要可單獨(dú)向本公司訂購，貨號(hào)為K0596。
6．對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板，建議在操作步驟之前，將模板RNA在65℃孵育5分
鐘立刻置于冰上，短暫離心后進(jìn)行下一步操作。
2．混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
3．cDNA合成反應(yīng)條件：
1）若下游進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，42℃孵育15分鐘，85℃孵育5分鐘。
2）若下游進(jìn)行普通PCR檢測(cè)，42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。
注意：對(duì)于二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜或GC含量高的模板，可以提高逆轉(zhuǎn)錄溫度至50℃，增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄效率。
4．反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心后置于冰上，再進(jìn)行后續(xù)PCR或熒光定量PCR，如果需要長(zhǎng)時(shí)
間保存，請(qǐng)置于-20℃。
注意：進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加量應(yīng)不超過PCR反應(yīng)總體積的1/10。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
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