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    AxyPrep無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒
    點(diǎn)擊次數(shù):1934 更新時(shí)間:2019-10-23

     

    AxyPrep無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒

     

    本試劑盒采用 SDS 堿裂解法,結(jié)合 DNA 制備膜選擇性吸附 DNA。同時(shí)采用特殊溶液(Buffer ETR 和 Buffer PF)有效去除內(nèi)毒素,可從 80-200 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取出多至 500 高純度質(zhì)粒 DNA,其內(nèi)毒素水平控制在 0.1 EU/ 以下。

     

    一、 試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性

     

     

    Cat. No.

    AP-MX-EP-2

    AP-MX-EP-10

    AP-MX-EP-25

     

    制備次數(shù)

    2 preps

    10 preps

    25 preps

     

    制備管(Maxiprep column

     

    2

     

    10

     

    25

     

    大量濾器(Maxiprep syringe filter

     

    2

     

    10

     

    25

     

    RNase A

    48 µl

    270 µl

    700 µl

     

    Buffer S1

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer S2

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer S3K

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer B

    24

    ml

    115

    ml

    285

    ml

     

    Buffer W1

    3

    ml

    160

    ml

    350

    ml

     

    Buffer W2 concentrate

    15

    ml

    66

    ml

    150

    ml

     

    ET-free water (70% Ethanol)

    1.8

    ml

    7.5

    ml

    18

    ml

     

    Eluent A

    8

    ml

    30

    ml

    70

    ml

     

    Buffer ETR

    10

    ml

    50

    ml

    120

    ml

     

    Buffer PF

    3

    ml

    13

    ml

    30

    ml

     

    說(shuō)明書(shū)

     

    1

     

    1

     

    1

     

     

    RNase A50 mg/ml,室溫可貯存 6 個(gè)月,長(zhǎng)期貯存于-20℃。

     

    Buffer S1:細(xì)菌懸浮液。加入 RNase A 后,混合均勻,4℃貯存。

     

    Buffer S2:細(xì)菌裂解液(含 SDS/NaOH),室溫密閉貯存。

     

    Buffer S3K:中和液,室溫密閉貯存。

     

    Buffer BDNA 結(jié)合溶液,室溫密閉貯存。

     

    Buffer W1:洗滌液,室溫密閉貯存。

     

    Buffer W2 concentrate:去鹽液。使用前,按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇(可用無(wú)水乙醇或 95%乙醇)。混合均勻,室溫密閉貯存。

     

    ET-free water (70% Ethanol):使用前,按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇(可用無(wú)水乙醇或 95%乙醇)。混合均勻,室溫密閉貯存。

     

    Eluent A:洗脫液。室溫密閉貯存。

     

    Buffer ETR:內(nèi)毒素去除液。室溫密閉貯存。

     

    Buffer PF:分相緩沖液。室溫密閉貯存。

     

     

    Page 1

     

    二、 注意事項(xiàng)

     

    • 細(xì)菌過(guò)量將影響細(xì)菌裂解、質(zhì)粒 DNA 的釋放,導(dǎo)致內(nèi)毒素含量過(guò)高。

     

    • 步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和。劇烈搖晃將導(dǎo)致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分,否則影響得率。

     

    • 在加入 Buffer S3K 時(shí),蛋白質(zhì)和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀,必須充分混合均勻,使凝集塊中間也得到充分中和凝結(jié)。

     

    • Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B  Buffer W1 含刺激性化合物,操作時(shí)要戴乳膠手套和防護(hù)眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣物,謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí),要立即用大量清水或生理鹽水沖洗,必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。

    三、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

     

    • 次使用前,RNase A 全部加入 Buffer S1 中,4℃貯存。

     

    • 次使用前,Buffer W2 concentrate 中加入體積的無(wú)水乙醇。

     

    • 次使用前,ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無(wú)水乙醇。使用前置于-20℃預(yù)冷。

     

    • 使用前,檢查 Buffer S2 是否出現(xiàn)沉淀,如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用。

     

    • Eluent A  65℃預(yù)熱后使用,有利于提高質(zhì)粒得率。

     

    • Buffer S3K、Buffer B  Buffer ETR 使用前置于 4℃預(yù)冷。

     

    • 準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的 Tip 頭、50ml 離心管。

     

    • 水平離心機(jī)(轉(zhuǎn)速可達(dá)到 4,000×g)及冷凍離心機(jī)(轉(zhuǎn)速可達(dá)到 8,000×g

     

    • 準(zhǔn)備 56℃水浴。

    四、 操作步驟

     

    80-200 ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液(若使用豐富培養(yǎng)基,菌液體積應(yīng)減半或更少),3,000 ×g 離心 8 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min,除盡上清。

    • 一般過(guò)夜培養(yǎng)的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間。若菌液 OD600 >4,菌量需減少。

    10 ml Buffer S1懸浮細(xì)菌沉淀,懸浮需均勻,不應(yīng)留有小的菌塊。

    確認(rèn) Buffer S1 中已加入 RNase A

    10 ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過(guò) 5 min。

    • Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH,降低溶菌效率。

    避免劇烈搖晃,否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染。

    此步驟不宜超過(guò) 5 min。

     

    • 10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer S3K,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合,直至溶液顏色均一并形成緊實(shí)的凝集塊,室溫放置 5 min
      • 加入 Buffer S3K 后應(yīng)立即混合,以避免形成局部的凝結(jié)塊。

     

    • 避免劇烈搖晃,否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染。

     

    5.10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer B,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合 10 次,8,000×g 離心(4℃)10 min

     

     

    步驟 6-9 可以選擇離心法或負(fù)壓法。

     

    • 離心法:

     

    6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中。吸取步驟 5 中的混合液,轉(zhuǎn)移到大量濾器Maxiprep syringe filter中。

     

    7A. 插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,6,000×g 離心 5 min。

     8A. 棄濾液,加 12 ml Buffer W1 至制備管中,6,000×g 離心 5 min。

    9A. 棄濾液,加 14 ml Buffer W2 至制備管中,6,000×g 離心 5 min。

     

    • 確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
    • 負(fù)壓法:

     

    6B. 正確連接負(fù)壓裝置,將大量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上。

    7B. 吸取步驟 5 中的上清液,轉(zhuǎn)移到大量濾器中,插入推桿,垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中,開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-25 ~ -30 英寸汞柱,緩慢吸走管中溶液。

    8B. 保持負(fù)壓,加 12 ml Buffer W1,吸盡管中溶液。

    9B. 保持負(fù)壓,加 14 ml Buffer W2,吸盡管中溶液。

    確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。

    再在大量制備管中加 4 ml Buffer W2,6,000×g 離心 5 min。

    將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中,在制備管膜中央加 2 ml Eluent A,室溫靜置 5 min,6,000×g 離心 5 min 收集質(zhì)粒 DNA。

    Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率。

    棄制備管。在濾液中加入 4 ml 預(yù)冷的 Buffer ETR,混合均勻。

    如果 Buffer ETR 渾濁,于冰上靜置,直至溶液變得清亮;如果分層,則混合均勻。

    加入 1 ml Buffer PF,混合均勻。

    *溶液可能會(huì)出現(xiàn)微弱的渾濁現(xiàn)象,此為正?,F(xiàn)象。

    置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min。

    孵育后溶液將出現(xiàn)大量乳白色沉淀,否則延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

    孵育后溶液有可能出現(xiàn)分層現(xiàn)象,此為正常現(xiàn)象。

    此步驟的離心必須使用吊籃式(swing-out rotor)離心機(jī)或其他水平離心機(jī)

     

    取無(wú)色上相至 50 ml 離心管中,加入 0.8 倍體積異丙醇(如:取得 6 ml 無(wú)色上相,則加入 4.8 ml 異丙醇),混合均勻。室溫靜置 10 min。8,000×g 離心 10 min。盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預(yù)冷的 ET-free water70% Ethanol,洗滌沉淀,8,000×g 離心 5 min。

    ET-free water70% Ethanol)使用前確定已加入體積的無(wú)水乙醇。

    盡可能棄盡上清。在超凈臺(tái)中干燥 10-15 min。

    管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄。

    加入 500  Eluent A 或無(wú)內(nèi)毒素水溶解質(zhì)粒 DNA。

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