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    孔雀石綠快速檢測試劑盒說明書
    點擊次數(shù):2848 更新時間:2019-01-11

    EF21A\J1                      2016-01

    孔雀石綠

    快速檢測試劑盒說明書

    一、原理

    本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物孔雀石綠將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物孔雀石綠的含量。

    二、試劑盒特性

    • 試劑盒靈敏度:   0.05ppb
    • 孵育溫度:       25
    • 孵育時間:       30min30min15min
    • 樣本檢測限

    水樣      ·······································  0.1ppb

    水產(chǎn)品    ·······································  0.5ppb    

    • 交叉反應(yīng)率

    顯性孔雀石綠  ·································   100%

    隱性孔雀石綠  ································    0.1%

    結(jié)      ····································    95%

    隱性結(jié)晶紫  ··································     0.1%

    • 樣本回收率

    水樣、水產(chǎn)品  ····························  80%~110%

    • 精密度

    板內(nèi)、板間變異系數(shù)≤12%

    三、試劑盒組成

    1

    微量測試孔

    每條8孔,一板12條

    2

    10倍濃縮標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶

    (1ml/瓶、黑色帽

    0ppb

    0.5ppb

    1.5ppb

    4.5ppb

    13.5ppb

    40.5ppb

    3

    酶標(biāo)記物

    12ml

    紅色帽

    4

    抗體工作液

    7ml

    藍色帽

    5

    底物A液

    7ml

    白色帽

    6

    底物B液

    7ml

    黑色帽

    7

    終止液

    7ml

    黃色帽

    8

    20X濃縮洗滌液

    40ml

    白色帽

    9

    氧化劑

    3ml

    白色帽

    10

    4X濃縮復(fù)溶液

    50ml

    透明帽

    四、所用儀器、試劑

    具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱

    微量移液器:單道 20200µl、單道1001000µl、多道 30300 µl

          劑:乙腈、二氯甲烷、無水硫酸鈉、正己烷

    五、樣本前處理步驟

    • 樣本處理前須知

    a)實驗中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時要更換吸頭。

    b)實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈,必要時可對實驗器具進行清潔,以避免污染干擾實驗結(jié)果。

    • 樣本前處理需配制:

    配液1 樣品提取液  

           乙腈-二氯甲烷混合溶液:

             V乙腈-V二氯甲烷  =  4 : 1, 取40ml乙腈,

          再加入10ml二氯甲烷,混勻后使用。

    配液2 樣品復(fù)溶液

        4X濃縮復(fù)溶液用去離子水按13稀釋

       (1份濃縮復(fù)溶液+3份去離子水),或按所

        需用量配制。

    • 樣本處理:
    • 水樣處理方法

       50µl清澈水樣樣直接測定(如果樣渾濁一定要過濾或4000r/min離心10min,直至得到清樣),暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

    樣本稀釋倍數(shù):  1

    • 水產(chǎn)處理方法
    • 稱取2±0.05g均質(zhì)組織樣品50ml離心管中,加入6ml樣品提取液(配液1),2g無水硫酸鈉,5min ,室溫(25℃左右4000r/min以上離心10min;
    • 3ml上清液,加入20µl氧化劑,搖勻,56℃條件下氮氣或空氣流吹至*干燥;
    • 加入1ml正己烷,加入1ml樣品復(fù)溶液(配液2),振蕩搖勻1min,4000r/min以上離心5min;
    • 下層50 µl用于分析;

    樣本稀釋倍數(shù):  1

    注:此方法所得到的結(jié)果為孔雀石綠;隱性孔雀石綠;結(jié)晶紫;隱性結(jié)晶紫的總量。

    六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

    • 測定前應(yīng)須知:
    • 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(2025)。
    • 使用之后立即將所有試劑放回28。
    • ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
    • 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
    • 操作步驟:
    • 28冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(2025)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
    • 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8。
    • 配液1:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。

    配液2:

    配制孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)液:取一定量的10倍濃縮

    標(biāo)準(zhǔn)液用樣品復(fù)溶10倍稀釋現(xiàn)配現(xiàn)用,

    具體如下:

        標(biāo)準(zhǔn)液6配制4.05ppb標(biāo)準(zhǔn)液--50ul 40.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻;

        標(biāo)準(zhǔn)液5配制1.35ppb標(biāo)準(zhǔn)液--50ul 13.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻;

        標(biāo)準(zhǔn)液4配制0.45ppb標(biāo)準(zhǔn)液--50ul 4.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻;

    標(biāo)準(zhǔn)液3配制0.15ppb標(biāo)準(zhǔn)液--50ul 1.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻;

    標(biāo)準(zhǔn)液2配制0.05ppb標(biāo)準(zhǔn)液--50ul 0.5ppb標(biāo)準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻;

    標(biāo)準(zhǔn)液1配制 0ppb標(biāo)準(zhǔn)液--50ul 0ppb標(biāo)

             準(zhǔn)液加450ul樣品復(fù)溶液混勻;

    • 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
    • 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加入抗體工作液50µl/孔,用蓋板膜封板,輕輕振蕩混勻。25環(huán)境中反應(yīng)30min。
    • 將孔內(nèi)液體甩干,用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔1530秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
    • 每孔加入酶標(biāo)記物100µl,蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌液充分洗,45遍(同上),用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
    • 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,25環(huán)境中避光顯色15min
    • 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

    七、結(jié)果判定

    結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含孔雀石綠量成負(fù)相關(guān)。

    1、粗略判定:

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb2.243; 0.05ppb1.816;0.15ppb1.415

     

    0.45ppb0.74;1.35ppb0.3134.05ppb0.155。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb4.05ppb;樣本2的濃度范圍是0.15ppb0.45ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

    2、定量分析

    1)百分吸光率的計算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以個標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

    百分吸光%)=

    B

    ×100%

    B0

    B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

    B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

    2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

    八、 注意事項

    • 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
    • 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
    • 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
    • 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
    • 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
    • 不用的微孔板放進自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
    • 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時,表示試劑可能變質(zhì)。
    • 該試劑盒理想反應(yīng)溫度為25℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

    九、儲藏條件和保質(zhì)期

    • 儲藏條件:試劑盒于2-8保存,不要冷凍。
    •  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

    提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實驗結(jié)果,請放心使用。

     

     

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